Kromatografi Nedir, Kromatografi Yöntemleri, Türleri Hakkında Bilgi

Kromatografi bir karışımın ayrılması için bir laboratuar tekniğidir. Karışım, mobil faz olarak adlandırılan ve sabit faz olarak adlandırılan başka bir malzemeyi tutan bir yapıya taşıyan bir sıvı içinde çözülür. Karışımın çeşitli unsurları farklı hızlarda hareket ederek ayrılmalarına neden olur. Ayırma, mobil ve sabit fazlar arasındaki diferansiyel bölünmeye dayanır. Bir bileşiğin bölme katsayısının küçük farkları, durağan fazdaki diferansiyel retansiyon ile sonuçlanır ve böylece ayrımı etkiler.

Kromatografi preparatif veya analitik olabilir. Hazırlayıcı kromatografinin amacı, bir karışımın bileşenlerini daha sonra kullanmak üzere ayırmaktır ve bu nedenle saflaştırma şeklidir. Analitik kromatografi, normal olarak daha az miktarda malzeme ile yapılır ve bir karışımdaki analitlerin göreceli oranlarını ölçmek veya varlığı oluşturmak içindir. İkisi karşılıklı olarak münhasır değildir.

Kromatografi Tarihçesi

Kromatografi, 1900 yılında İtalyan doğumlu bilim adamı Mikhail Tsvet tarafından Rusya’da ilk kez çalıştırıldı. 20. yüzyılın ilk on yıllarında kromatografi ile çalışmaya devam etti, öncelikle klorofil, karotenler ve ksantofiller gibi bitki pigmentlerinin ayrılması için. Bu bileşenler farklı renklere sahip oldukları için (sırasıyla yeşil, turuncu ve sarı) tekniğin adını verdiler. 1930 ve 1940’larda geliştirilen yeni kromatografi tekniği, tekniği birçok ayrıştırma işlemi için yararlı kılmıştır.

Kromatografi tekniği, 1940’lar ve 1950’lerde Archer John Porter Martin ve Richard Laurence Millington Synge’in çalışmalarının bir sonucu olarak geliştirildi ve Nobel ödülünü kazandılar. Bölme kromatografisinin ilkelerini ve temel tekniklerini belirlediler ve çalışmalar, kağıt kromatografisi, gaz kromatografisi ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi olarak bilinen şeyin birkaç kromatografik yöntemin hızlı gelişimini teşvik etti. O zamandan beri teknoloji hızla gelişti. Araştırmacılar Tsvet’in kromatografisinin ana ilkelerinin aşağıda tanımlanan farklı kromatografi çeşitliliğine neden olacak şekilde birçok farklı yoldan uygulanabileceğini bulmuşlardır. Gelişmeler kromatografinin teknik performansını sürekli geliştiriyor ve giderek benzer moleküllerin ayrılmasına imkân tanıyor.

Kromatografi Türleri

Gaz Kromatografisi

Gaz-kromotografi (GLC) bu gaz-sıvı kromatografisi olarak da bilinir (GLC), mobil fazın bir gaz olduğu bir ayırma tekniğidir. Gaz kromatografisi ayırımı her zaman tipik olarak “paketlenmiş” veya “kılcal” bir sütun içerisinde gerçekleştirilir. Paketlenmiş sütunlar, gaz kromatografisinin rutin iş atlarıdır, daha ucuz ve daha kolay kullanılır ve çoğunlukla yeterli performans verirler. Kılcal sütunlar genel olarak daha üstün çözünürlük verir ve özellikle kompleks karışımlar için daha pahalı hale gelir. Her iki tip sütun adsorbe olmayan ve kimyasal olarak inert materyalden yapılır. Paslanmaz çelik ve cam, dolgulu sütunlar ve kılcal sütunlar için eritilmiş silis için olağan malzemelerdir.

Sıvı Kromatografisi

Sıvı Kromatografisi (LC), mobil fazın bir sıvı olduğu bir ayırma tekniğidir. Bu, bir sütunda veya bir düzlemde gerçekleştirilebilir. Günümüzde genellikle çok küçük paketleme parçacıklarını ve nispeten yüksek bir basıncı kullanan sıvı kromatografiye, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) adı verilir.

Afinite kromatografisi

Afinite kromatografisi bir analit ile belirli moleküller arasındaki seçici olmayan kovalent etkileşime dayanmaktadır. Çok özeldir, ancak çok sağlam değildir. Genellikle biyokimyada etikete bağlı proteinlerin saflaştırılmasında kullanılır. Bu füzyon proteinleri, özel olarak sabit faza bağlanan His-etiketleri, biyotin veya antijenler gibi bileşiklerle etiketlenir. Saflaştırmadan sonra, bu etiketlerden bazıları genellikle kaldırılır ve saf protein elde edilir.

Afinite kromatografisi çoğunlukla bir metal (Zn, Cu, Fe, vb.) Için bir biyomolekülün afinitesini kullanır. Kolonlar genellikle el ile hazırlanır. Geleneksel afinite sütunları, istenmeyen biyomoleküllerin yıkanması için hazırlayıcı bir adım olarak kullanılır.

Süperkritik sıvı kromatografisi

Süperkritik akışkan kromatografisi, mobil fazın kritik sıcaklık ve basıncın üzerine ve nispeten yakın bir sıvı olduğu bir ayırma tekniğidir.

Süperkritik Akışkan Kromatografisi (SFC), düşük molekül ağırlıklı, orta derecede moleküler ağırlıklı, termal olarak kararsız moleküllerin analizi ve saflaştırılması için kullanılan 1962’de ilk kez kullanılan normal faz kromatografisinin bir formudur. Şiral bileşiklerin ayrılması için de kullanılabilir. Prensipler, yüksek performanslı sıvı kromatografisiyle (HPLC) benzer ancak SFC genellikle mobil faz olarak karbondioksit kullanır; Bu nedenle tüm kromatografik akış yolu basınç altına alınmalıdır. Süperkritik faz, sıvı ve gaz özelliklerinin birleştiği bir durumu temsil ettiği için, süper kritik akışkan kromatografiye bazen “yakınsama kromatografisi” adı verilir.

İyon değişimi kromatografisi

İyon değiştirme kromatografisi (genellikle iyon kromatografisi olarak anılır), analitleri ilgili yüklerine göre ayırmak için bir iyon değiştirme mekanizması kullanır. Genellikle sütunlarda yapılır, ancak düzlemsel modda da yararlı olabilir. İyon değiştirme kromatografisi, anyon, katyon, amino asit, peptid ve protein içeren yüklü bileşikleri ayırmak için yüklü bir durağan faz kullanır.


Ebat-eksklüzyon kromatografisi

Ebat-eksklüzyon kromatografisi (SEC), jel permeasyon kromatografisi (GPC) veya jel filtrasyon kromatografisi olarak da bilinir ve molekülleri boyutlarına göre (veya hidrodinamik çaplarına veya hidrodinamik hacimlerine göre daha doğru şekilde) ayırır. Daha küçük moleküller medyanın gözeneklerine girebilir ve bu nedenle moleküller tutulur ve hareketli fazın akışından uzaklaştırılır. Gözeneklerin ortalama kalış süresi analit moleküllerinin etkili büyüklüğüne bağlıdır. Bununla birlikte, ambalajın ortalama gözenek boyutundan daha büyük olan moleküller hariç tutulur ve dolayısıyla esasen hiç bir tutuş olmaz; Bu türler ilk çıkan ürünlerdir. Genellikle düşük çözünürlüklü bir kromatografi tekniğidir ve bu nedenle çoğunlukla bir arındırmanın son “cilalama” basamağı için ayrılmıştır. Saflaştırılmış proteinlerin üçüncül yapısını ve kuaterner yapısını belirlemek için de, özellikle yerel çözelti koşulları altında gerçekleştirilebildiğinden yararlıdır.

Genişletilmiş yatak adsorpsiyon kromatografik ayrılması

Bir biyokimyasal ayırma işlemi için genişletilmiş bir yatak kromatografik adsorpsiyon (EBA) kolonu, genleşmiş yatağın tabanında gözenekli bir engelleyici elek plakasının altında bir kendi kendini temizleme işlevine sahip olan bir basınç dengeleme sıvısı dağıtıcısını, bir ters yıkamalı temizleme işlevine sahip olan bir üst parça meme düzeneğini Genişletilmiş yatağın üst kısmında, genleşmiş yatak katından geçen sıvının bir piston akışı durumu sergilediğinden, genişletilmiş yatağa ilave edilen besleme stoku likörünün daha iyi bir dağılımı. Genişletilmiş yatak tabakası piston akışı durumunu gösterir. Genişletilmiş yatak kromatografik ayırma sütunu, genleşmiş yatağın ayrılma verimliliğini arttırma avantajlarına sahiptir.

Kromatografi Özel teknikler

Ters fazlı kromatografi

Ters fazlı kromatografi (RPC), mobil fazın durağan fazdan önemli ölçüde daha polar olduğu herhangi bir sıvı kromatografi prosedürüdür. Normal faz sıvı kromatografisinde mobil fazın durağan fazdan polar olduğu belirlenmiştir. Mobil fazdaki hidrofobik moleküller nispeten hidrofobik durağan faza adsorbe olma eğilimindedir. Mobil fazdaki hidrofilik moleküller önce elüe eğilimli olacaktır. Ayırma sütunları tipik olarak bir silika parçacık substratına bağlanmış bir C8 ya da C18 karbon zincirini içermektedir.

Hidrofobik etkileşim kromatografisi
Proteinler arasındaki hidrofobik etkileşimler ve kromatografik matris proteinleri saflaştırmak için kullanılabilir. Hidrofobik etkileşim kromatografisinde matris malzemesi hafifçe hidrofobik gruplarla değiştirilir. Bu gruplar metil, etil, propil, oktil veya fenil gruplarından olabilir. Yüksek tuz konsantrasyonlarında protein üzerindeki yüzeydeki polar olmayan yan zincir hidrofobik gruplarla “etkileşime geçer”; Yani her iki gruptaki grup polar çözücü tarafından dışlanır (hidrofobik etkiler artmış iyonik kuvvetle arttırılır). Böylece, numune, son derece polar olan bir tamponda kolona uygulanır. Seyreltici, tipik olarak, azaltılmış tuz konsantrasyonları, deterjan konsantrasyonlarının artması (hidrofobik etkileşimleri bozar) ya da pH’daki değişimleri içeren sulu bir tampondur.

İki boyutlu kromatografi
Bazı durumlarda, belirli bir kolondaki kimya, bazı analitleri ayırmak için yetersiz olabilir. Çözülmemiş zirveler dizisini, farklı fiziko-kimyasal (Kimyasal sınıflandırma) özelliklerine sahip ikinci bir kolona yönlendirmek mümkündür. Bu yeni katı desteğin üzerinde tutulma mekanizması, birinci boyutsal ayrıştırmadan farklı olduğu için, tek boyutlu kromatografi ile ayırt edilemeyen bileşikleri ayırmak mümkün olabilir. Numune, bir kare plakanın bir köşesinde bulunur, geliştirilir, havayla kurutulur, daha sonra 90 ° döndürülür ve genellikle ikinci bir çözücü sisteminde yeniden geliştirilir.

Hareketli yataklı kromotografi simülasyonu

Benzetimli hareketli yatak (SMB) tekniği, yüksek performanslı sıvı kromatografisinin bir varyantıdır; Aksi takdirde çözülmesi zor veya imkansız olan parçacıkları ve / veya kimyasal bileşikleri ayırmak için kullanılır. Bu artan ayrım, durağan fazı süresiz uzatmak için kullanılan bir vana-sütun düzenlemesi ile sağlanır. Hazırlayıcı kromatografinin hareketli yatak tekniğinde yem girişi ve analit geri kazanımı eşzamanlı ve sürekli olmakla birlikte, sürekli hareket eden bir yatakta pratik zorluklar nedeniyle benzetimli hareketli yatak tekniği önerilmiştir. Yatağı hareket ettirmek yerine benzetimli hareketli yatak tekniğinde, numune girişi ve analit çıkış konumları hareketli bir yatak izlenimi vererek sürekli hareket ettirilir.

Piroliz gaz kromatografisi

Piroliz gaz kromatografisi kütle spektrometresi, gaz kromatografisi ile ayrılan ve kütle spektrometresi kullanılarak tespit edilen daha küçük moleküller üretmek için numunenin bozunmaya kadar ısıtıldığı bir kimyasal analiz yöntemi.

Piroliz, malzemelerin inert bir atmosferde veya vakumda termal ayrışmasıdır. Numune bir platin telle doğrudan temasa sokulur veya bir kuvars numune tüpüne yerleştirilir ve hızla 600-1000 ° C’ye kadar ısıtılır. Uygulamaya bağlı olarak daha yüksek sıcaklık kullanılır. Gerçek pirolizörlerde üç farklı ısıtma tekniği kullanılır: İzotermal fırın, endüktif ısıtma (Curie Point filament) ve platin filamentleri kullanarak dirençli ısıtma. Büyük moleküller, en zayıf noktalarında parçalanırlar ve daha küçük, daha uçucu parçalar üretirler. Bu fragmanlar gaz kromatografisiyle ayrılabilir. Piroliz GC kromatogramları tipik olarak karmaşıktır, çünkü geniş bir yelpazede farklı dekompozisyon ürünleri oluşur. Veriler, ya materyal kimliğini kanıtlamak için parmak izi olarak kullanılabilir ya da yapısal bilgi edinmek için tek tek fragmanları tanımlamak için GC / MS verileri kullanılır. Kutup parçalarının uçuculuğunu arttırmak için pirolizden önce bir numuneye çeşitli metilasyon reaktifleri eklenebilir.

Özel pirolizatörlerin yanı sıra katı ve sıvı numunelerin piroliz GC’leri, hızlı ısıtma (30 ° C / s’ye kadar) ve 600-650 ° C’lik yüksek maksimum sıcaklıklar sağlayan Programlanabilir Sıcaklık Vaporizörü (PTV) enjektörleri içerisinde doğrudan gerçekleştirilebilir. Bu, bazı piroliz uygulamaları için yeterlidir. En büyük avantajı, hiçbir özel alet satın alınması gerekmemesi ve rutin GC analizinin bir parçası olarak piroliz yapılabilmesidir. Bu durumda kuvartz GC giriş gömleği kullanılmalıdır. Kantitatif veriler elde edilebilir ve PTV enjektörü içindeki türevlendirmenin iyi sonuçları da yayınlanır.

Hızlı protein sıvı kromatografisi

Hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC), proteinlerin karışımlarını analiz etmek veya saflaştırmak için sıklıkla kullanılan bir sıvı kromatografi formudur. Diğer kromatografi şekillerinde olduğu gibi, bir karışımın farklı bileşenleri, iki materyal, hareketli bir sıvı (“mobil faz”) ve gözenekli bir katı (sabit faz) için farklı afinitelere sahip olduğu için ayrılma mümkündür. FPLC’de mobil faz, sulu bir solüsyondur veya “tampon” dur. Tampon akış hızı, pozitif deplasmanlı bir pompa tarafından kontrol edilir ve normal olarak sabit tutulur; tamponun bileşimi, iki veya daha fazla dış rezervuardan farklı oranlarda akışkanlar çizerek değiştirilebilir. Sabit faz, genellikle silindirik bir cam veya plastik kolona doldurulmuş, çapraz bağlı agarozdan oluşan boncuklardan oluşan bir reçinedir. FPLC reçineleri, uygulamaya bağlı olarak geniş boncuk boyutlarında ve yüzey ligandlarında mevcuttur.

Karşı akım kromatografisi

Karşı akım kromatografisi (CCC), hem durağan hem de hareketli fazların sıvı olduğu bir sıvı-sıvı kromatografısidir. CCC ekipmanının çalışma prensibi, bir bobin etrafında sarılmış açık bir tüpten oluşan bir sütun gerektirir. Bobin, her dönme sırasında sütun üzerinde değişken yerçekimi (G) alanının hareket etmesine neden olan çift eksenli bir dönme hareketiyle (bir kardiyoid) döndürülür. Bu hareket, sütun, devir başına bir bölümleme adımı görmesine ve kullanılan iki karışmayan sıvı faz arasındaki bölümleme katsayısı nedeniyle, numunenin bileşenleri kolondan ayrılmasına neden olur. Bugün mevcut birçok CCC türü vardır. Bunlara HSCCC (Yüksek Hız CCC) ve HPCCC (Yüksek Performanslı CCC) dahildir. HPCCC şu an kullanılan enstrümanın en yeni ve en iyi performans gösteren versiyonudur.

Şiral kromatografi

Kiral kromatografi, stereoizomerlerin ayrılmasını içerir. Enantiomerler durumunda, bunların üç boyutlu ayna görüntüleri olmaktan başka hiçbir kimyasal veya fiziksel farklılığı yoktur. Konvansiyonel kromatografi veya diğer ayırma işlemleri onları ayırabilmektedir. Şiral ayrılmaların gerçekleşmesini sağlamak için, hareketli faz veya durağan faz kendileri, analitler arasında farklı afiniteler kazandırarak kendinden kiral hale getirilmelidir. Hem normal hem de ters fazda kiral kromatografi HPLC kolonları (kiral sabit fazda) ticari olarak mevcuttur.

Sitede Ara